Activación/acondicionamiento de la columna de HPLC

Al considerar cuál es el acondicionamiento que se necesita, debe prestarse atención a lo siguiente:

Disolvente en el que se envía la columna

Fase móvil deseada para análisis

Deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:

Si los dos disolventes son miscibles

Si el sistema de disolvente final contiene tampones que pueden precipitar.

Cuando se trabaja con columnas de fase reversa que se envían normalmente en acetonitrilo:agua 65:35 y que se usan generalmente con mezclas de metanol o acetonitrilo con agua o un tampón, a menudo es posible pasar directamente a la fase móvil prevista. Si las concentraciones de tampón son superiores a 20 mM, podría ser necesario cambiar primero a la nueva proporción orgánico/agua antes de introducir el tampón con fin de reducir cualquier riesgo de precipitación salina.

Una pequeña cantidad de fases estacionarias (ciano, amino, diol) pueden usarse tanto en fase normal como en fase reversa. Se envían generalmente en mezclas de fase normal, y si van a usarse en fase reversa, se requiere hacer el cambio mediante un disolvente miscible universal, para lo que puede recurrirse a un protocolo como el siguiente:

Disolvente en que se envía la columna hexano:ACN 99:1

Fase móvil deseada metanol:agua 50:50

Lavar la columna con 30 volúmenes de columna de THF o IPA

Lavar con 10 volúmenes de columna de metanol

Lavar con metanol:agua 50:50 hasta conseguir una base de referencia estable

En este proceso, se usa primero el THF o el IPA para eliminar el hexano de la columna. Esto es importante porque el hexano no se mezclará con el metanol ni con el agua. El metanol sustituirá entonces al THF o al IPA en la columna antes de introducir la fase móvil. A la hora de elegir entre THF o IPA, debe tenerse en cuenta el sistema HPLC. Si los tubos o conexiones del sistema son de PEEK, no podrá usarse entonces THF y se prefiere usar IPA en su lugar. Si la conexión del sistema es de acero inoxidable, puede usarse tanto THF como IPA, aunque el THF tiene la ventaja de ser menos viscoso.

Al acondicionar una columna para su uso en un sistema en gradiente, es una buena práctica lavar la columna con un disolvente fuerte (generalmente disolvente B) antes de equilibrarla en el punto de inicio del gradiente. De esta forma se garantiza que la columna proporcionará un buen punto de referencia cuando el gradiente esté en marcha. También resulta buena idea realizar dos o tres gradientes en vacío antes de inyectar un estándar de prueba.

Entonces surge a menudo la siguiente pregunta: “¿Cómo saber que mi columna está totalmente acondicionada?”. Hay dos formas prácticas de verlo.

Si se usa un detector UV, la línea base debería ser plana; en general, cuando se hace algún cambio en la composición del disolvente, la línea base se inclinará. Y cuando se nivela, es una buena indicación de que la columna ha alcanzado el equilibrio con la fase móvil y ya puede usarse.

Contrapresión: Cuando se cambian los disolventes, tanto al acondicionar una nueva columna o al final de un gradiente, la contrapresión medida por el sistema cambiará. La presión se estabilizará con el tiempo, indicando que la columna ha alcanzado el equilibrio. Esto puede ser útil al trabajar con sistemas MS, en los que normalmente la línea base no se monitoriza.