Im technischen Tipp dieses Monats sehen wir uns an, was mit Säulenkonditionierung und/oder -aktivierung gemeint ist.
Vor dem Versand werden alle HLPC-Säulen von Phenomenex einer Qualitätskontrolle (QC) unterzogen, wobei das Versandlösungsmittel generell das gleiche ist wie das Testlösungsmittel, es sei denn, auf dem CQA-Dokument, das mit der Säule mitgeschickt wird, steht etwas anderes. „Säulenkonditionierung“ oder „-aktivierung“ sind Begriffe, die im Allgemeinen untereinander austauschbar sind. Einfach ausgedrückt bezeichnen sie die Schritte, die ergriffen werden, um eine Säule von ihrem Versand- oder Lagerungslösungsmittel auf das Lösungsmittelsystem umzustellen, das in der spezifischen Analysemethode benutzt wird.
Bei der Überlegung, welche Konditionierung erforderlich ist, sollte Folgendes beachtet werden:
Die folgenden Fragen sollten berücksichtigt werden:
Bei der Arbeit mit Umkehrphase-Säulen, die üblicherweise in einem Gemisch aus 65 % Acetonitril und 35 % Wasser versandt werden und die häufig mit Gemischen aus Methanol oder Acetonitril mit Wasser oder einem Puffer eingesetzt werden, ist oft ein direkter Wechsel zur geplanten mobilen Phase möglich. Wenn die Pufferkonzentrationen höher als 20 mM sind, kann es nötig sein, vor dem Einsatz des Puffers zuerst zu einem neuen Organik-Wasser-Verhältnis mit höherem Wasseranteil zu wechseln, um das Risiko einer Salzausfällung zu reduzieren.
Eine kleine Anzahl stationärer Phasen (Cyano, Amino, Diol) kann sowohl in Normalphase als auch in Umkehrphase verwendet werden. Diese werden üblicherweise unter Normalphase-Bedingungen versandt. Für die Verwendung in der Umkehrphase ist jedoch ein Zwischenspülschritt über ein universell mischbares Lösungsmittel erforderlich, für den folgendes Protokoll genutzt werden kann:
In diesem Prozess wird das THF oder der IPA zuerst genutzt, um das Hexan aus der Säule zu entfernen. Dies ist wichtig, da Hexan nicht mit Methanol oder Wasser mischbar ist. Das Methanol ersetzt dann das THF oder den IPA in der Säule, bevor die mobile Phase verwendet wird. Bei der Wahl zwischen THF und IPA sollte das HPLC-System berücksichtigt werden. Wenn die Systemkapillaren oder Fittinge aus PEEK bestehen, kann THF nicht benutzt werden, weshalb IPA bevorzugt wird. Wenn das System mit Edelstahlkapillaren ausgestattet wird, können THF oder IPA verwendet werden, wobei THF den Vorteil einer geringeren Viskosität hat.
Wenn die Säule zur Verwendung in einer Gradientenmethode konditioniert wird, ist es eine bewährte Methode, die Säule zunächst mit dem starken Lösungsmittel (üblicherweise Lösungsmittel B) zu spülen, bevor die Säule mit den Startbedingungen des Gradienten äquilibriert wird. Dies stellt sicher, dass die Säule eine gute Basislinie liefert, wenn der Gradient durchgeführt wird. Eine weitere gute Idee ist, zwei oder drei Leergradienten zu fahren, bevor ein Teststandard injiziert wird.
Eine häufig aufkommende Frage ist „wie weiß ich, dass meine Säule vollständig konditioniert ist?“ Es gibt zwei hilfreiche Möglichkeiten, dies zu ermitteln.
