Pufr je VODNÍ roztok obsahující slabou kyselinu a její konjugovanou bázi (nebo slabou bázi a její konjugovanou kyselinu). Po přidání malého množství silné kyseliny nebo zásady se pH pufrovacího roztoku mění velmi málo a může tak pomoci zamezit změnám podmínek v analytické metodě při malých odchylkách faktorů prostředí. Pufrovací roztoky se používají k udržení pH na téměř konstantní hodnotě. Jsou odolné vůči změně pH v důsledku přítomnosti rovnováhy mezi touto slabou kyselinou (HA) a její konjugovanou bází (B).
(kyselina) ⇌ (vodíkový ion) + (konjugovaná báze)
Jak fungují pufry.
Když se do rovnovážné směsi slabé kyseliny a její konjugované báze přidá nějaká silná kyselina (více H+), rovnováha se posune doleva v souladu s Le Chatelierovým principem. Podobně, pokud je do směsi přidána silná báze, koncentrace vodíkových iontů klesá o méně než množství očekávané pro množství přidané báze.
Při přípravě pufrů existuje několik obecných pokynů, které byste měli dodržovat:
- Kalibrujte pH metr; ideálně při hodnotách pH nad a pod cílovou hodnotou pro přípravu pufru. K tomuto účelu se prodávají kalibrační pufrovací roztoky.
- Odvažte sůl pufru, abyste dosáhli požadované koncentrace pufru.
- Přidejte ji do odměrné baňky obsahující vodu v čistotě pro HPLC a důkladně promíchejte, aby se rozpustila.
- Pomocí pH sondy a pH metru změřte pH roztoku.
- Upravte pH na požadovanou hodnotu přidáním malého objemu silné kyseliny a/nebo silné báze.
- Jakmile je pH správné, zřeďte roztok na konečný požadovaný objem a dobře promíchejte.
V HPLC se pufry obvykle používají k ovlivnění sekundárních interakcí, které jsou v chromatografii obecně považovány za „nežádoucí“. Používají se také k řízení ionizačního stavu analytu, aby se zajistilo, že není přítomen ve více než jednom ionizovaném stavu. pKa sloučeniny představuje pH, při kterém je z 50% ionizovaná a z 50% neutrální. Pokud pracujete při tomto pH, uvidíte rozdělené píky (split peaks) a proměntlivé retenční časy. Všechny metody by měly být alespoň dvě jednotky pH od pKa cílového analytu.
Při přípravě izokratických mobilních fází je několik dalších hledisek k zajištění dostatečné robustnosti metody.
- Pokud je to možné, předem promíchejte svou mobilní fázi, čímž se eliminuje chyba pumpy.
- Pro přípravu používejte vždy stejnou metodu; například pokud nejprve přidáte vodu, měli byste ji vždy přidat jako první. Pokud jednotlivé komponenty změříte a poté promícháte, měli byste to dělat vždy tímto způsobem. Tento proces neměňte, protože výsledky se mohou významně lišit, pokud jde o retenční čas analytu.
Níže je experiment, který ukazuje tuto variabilitu, když byly mobilní fáze smíchány následujícími způsoby.
- Nejprve voda: 400 ml vody v odměrném válci, přidejte do 1 litrové odměrné baňky, zřeďte po značku MeOH
- Nejprve MeOH: 600 ml MeOH v odměrném válci, přidejte do odměrné baňky o objemu 1 litr, zřeďte po značku vodou
- MeOH a voda měřeny jednotlivě: 600 ml MeOH v odměrném válci, přenos do zásobníku mobilní fáze; 400 ml vody ve stejném odměrném válci a převedeno do zásobníku mobilní fáze
- Nechte čerpadlo smíchat A = vodu s B = MeOH
Průtok 1.25mL/min
Objem nástřiku 2µL
Koncentrace pufru jsou také důležité, obecně se má za to, že koncentrace pod 10 mM nenabízejí pufrovací kapacitu potřebnou k ovlivnění aktivity silanolu, nebo ionizačního stavu sloučeniny. Koncentrace 10 mM je považována za minimální efektivní koncentraci pro reverzní fázi a HILIC. U jiných technik, jako je size exlucion, jsou vyžadovány výrazně vyšší koncentrace a u těchto metod nejsou neobvyklé koncentrace vyšší než 100 mM. Koncentrace pufru je něco, co musí být pečlivě vyváženo, aby byla zajištěna rozpustnost za všech podmínek. Pokud pracujete s reverzní fází, možná budete muset omezit koncentraci pufru, se kterým pracujete, pokud metoda obsahuje vysoké hladiny organických látek (například přes gradient), aby se předešlo vysrážení pufru.
Mobilní fáze přispívá k selektivitě stejně jako Vaše stacionární fáze. Její správný výběr a příprava je stejně důležitá jako testování šarží stacionárních fází při vývoji robustních HPLC metod.