Důležitost správně připravené mobilní fáze

Technický tip pro HPLC / UHPLC.

Change Language

French

German

Spanish

Italian

Polish

Czech

Pufr je VODNÍ roztok obsahující slabou kyselinu a její konjugovanou bázi (nebo slabou bázi a její konjugovanou kyselinu). Po přidání malého množství silné kyseliny nebo zásady se pH pufrovacího roztoku mění velmi málo a může tak pomoci zamezit změnám podmínek v analytické metodě při malých odchylkách faktorů prostředí. Pufrovací roztoky se používají k udržení pH na téměř konstantní hodnotě. Jsou odolné vůči změně pH v důsledku přítomnosti rovnováhy mezi touto slabou kyselinou (HA) a její konjugovanou bází (B).

HA ⇌H^++A^-
(kyselina) ⇌ (vodíkový ion) + (konjugovaná báze)

Jak fungují pufry.
Když se do rovnovážné směsi slabé kyseliny a její konjugované báze přidá nějaká silná kyselina (více H+), rovnováha se posune doleva v souladu s Le Chatelierovým principem. Podobně, pokud je do směsi přidána silná báze, koncentrace vodíkových iontů klesá o méně než množství očekávané pro množství přidané báze.

Při přípravě pufrů existuje několik obecných pokynů, které byste měli dodržovat:

V HPLC se pufry obvykle používají k ovlivnění sekundárních interakcí, které jsou v chromatografii obecně považovány za „nežádoucí“. Používají se také k řízení ionizačního stavu analytu, aby se zajistilo, že není přítomen ve více než jednom ionizovaném stavu. pKa sloučeniny představuje pH, při kterém je z 50% ionizovaná a z 50% neutrální. Pokud pracujete při tomto pH, uvidíte rozdělené píky (split peaks) a proměntlivé retenční časy. Všechny metody by měly být alespoň dvě jednotky pH od pKa cílového analytu.

Fig 1.
Fig 2.

Při přípravě izokratických mobilních fází je několik dalších hledisek k zajištění dostatečné robustnosti metody.

Níže je experiment, který ukazuje tuto variabilitu, když byly mobilní fáze smíchány následujícími způsoby.

  1. Nejprve voda: 400 ml vody v odměrném válci, přidejte do 1 litrové odměrné baňky, zřeďte po značku MeOH
  2. Nejprve MeOH: 600 ml MeOH v odměrném válci, přidejte do odměrné baňky o objemu 1 litr, zřeďte po značku vodou
  3. MeOH a voda měřeny jednotlivě: 600 ml MeOH v odměrném válci, přenos do zásobníku mobilní fáze; 400 ml vody ve stejném odměrném válci a převedeno do zásobníku mobilní fáze
  4. Nechte čerpadlo smíchat A = vodu s B = MeOH
Fig 3.
Kinetex® 5μm XB-C18 150 x 4.6mm; 60:40 MeOH: H20
Průtok 1.25mL/min
Objem nástřiku 2µL

Koncentrace pufru jsou také důležité, obecně se má za to, že koncentrace pod 10 mM nenabízejí pufrovací kapacitu potřebnou k ovlivnění aktivity silanolu, nebo ionizačního stavu sloučeniny. Koncentrace 10 mM je považována za minimální efektivní koncentraci pro reverzní fázi a HILIC. U jiných technik, jako je size exlucion, jsou vyžadovány výrazně vyšší koncentrace a u těchto metod nejsou neobvyklé koncentrace vyšší než 100 mM. Koncentrace pufru je něco, co musí být pečlivě vyváženo, aby byla zajištěna rozpustnost za všech podmínek. Pokud pracujete s reverzní fází, možná budete muset omezit koncentraci pufru, se kterým pracujete, pokud metoda obsahuje vysoké hladiny organických látek (například přes gradient), aby se předešlo vysrážení pufru.

Mobilní fáze přispívá k selektivitě stejně jako Vaše stacionární fáze. Její správný výběr a příprava je stejně důležitá jako testování šarží stacionárních fází při vývoji robustních HPLC metod.