Technischer Tipp zur Probenvorbereitung
Niveau: Fortgeschritten
Probenvorbereitung für Oligonukleotide
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Willkommen zurück zu unserem monatlichen technischen Tipp! Diesen Monat behandeln wir das Thema Probenvorbereitung für Oligonukleotide.
Oligonukleotide sind hochgradig zielgerichtete therapeutische Wirkstoffe, die zur Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheitszuständen eingesetzt werden. Während des Entwicklungsprozesses von Medikamenten muss die Pharmakokinetik der Therapeutika bewertet werden, was auch für Oligo-Therapeutika gilt. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen stellen Oligos jedoch einige einzigartige Herausforderungen dar.
Traditionelle Methoden zur Extraktion von Oligonukleotiden verwenden eine Flüssig-Flüssig-Extraktion und die Oligonukleotide werden in die wässrige Schicht extrahiert, die dann entfernt und mit einem Standard-SPE-Protokoll verwendet wird. Dieser gesamte Prozess ist langwierig und schwer zu automatisieren. Andere verfügbare Optionen. Clarity™ OTX macht die Flüssig-Flüssig-Extraktion überflüssig, reduzieren die Bildung von Emulsionen und bieten eine Plattform, die automatisiert werden kann. Clarity OTX bietet eine gute Standardlösung für die Extraktion von Oligonukleotiden aus Plasma- und Serumproben; das generische Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
| Proben-Vorbehandlung: | |||
|---|---|---|---|
| Biologische Flüssigkeiten | Probe mit Lysis-Loading-Puffer (1:1 oder 1:2) mischen | ||
| Gewebe | 1.Eine Proteinase-K-Verdauung oder Homogenisierung des Gewebes durchführen. 2.Probe mit Lysis-Loading-Puffer (1:1 oder 1:2) mischen |
||
| SPE-Protokol | |||
| Lösungsmittel / Puffer | Volumina | ||
| Schritt | 96-Well-Plate | 100 mg | 2 mg |
| Konditionierung | Methanol | 1 ml | 200 µl |
| Äquilibrieren | 50 mM Ammoniumacetate, pH 5,5
*Für Gewebeproben 0,5% TX-100, 0,1% Cystein zu dem oben genannten Puffer hinzufügen |
1 ml | 200 µl |
| Beladen | Vorbehandelte Probe | Bis zu 0,5 ml | 100 µl |
| Waschen | 50 mM Ammoniumacetate, pH 5,5/ Acetonitrile (50:50) | 3x 1ml | 2-3 x 100 µl |
| Eluieren | 100mM Ammoniumbicarbonat, (pH 9,5) / Acetonitril / Tetrahydrofuran (50:40:10) | 1ml | 2 x 75 µl |
Eine der großen Herausforderungen sind Gewebeproben. Bei der Arbeit mit Gewebeproben wird die Zugabe von Proteinase K empfohlen, da es sich um eine unspezifische Protease handelt, die die enzymatische Aktivität unter denaturierenden Bedingungen und Hitze verbessern kann. Es ist auch eine gute Praxis, während dieses Schritts Keramikkügelchen hinzuzufügen, um das Gewebe zu lysieren. Bei Gewebeproben kann auch eine gewisse Optimierung der Wasch- und Elutionsschritte erforderlich sein.
Tipps zur Methodenoptimierung:
Bei den Waschlösungen müssen Sie sicherstellen, dass Sie mit einem pH-Wert von 5,5 arbeiten, da dies für die Retention des Oligonukleotids auf dem Sorbens entscheidend ist. Eine Erhöhung des organischen Anteils oder die Verwendung eines anderen organischen Additivs kann die Probenreinigung unterstützen, indem die durch hydrophobe Wechselwirkungen zurückgehaltenen Verunreinigungen effizienter eluiert werden. Der Vorteil des Ionenaustauschs bei der Isolierung ist, dass stärkere Waschlösungsmittel verwendet werden können, solange der pH-Wert beibehalten wird.
Im Falle des Elutionsschritts können verbesserte Wiederfindungsraten erzielt werden, indem der pH-Wert der Elutionslösung erhöht und die Mischung der verwendeten organischen Zusätze angepasst wird, wobei ein 50:50-Verhältnis von Puffer zu organischem Inhalt beibehalten wird. Vorschläge zur Optimierung der Wasch- und Elutionspuffer sind in Abbildung 2 zusammengefasst. Ein weiterer Tipp zur Verhinderung der Oxidation von PS zu PO während des Elutionsschritts ist die Zugabe von TCEP zum Elutionspuffer.
| Schritt | Modifikation |
|---|---|
| Waschen | 50mM Ammoniumacetat pH 5.5: Acetonitril: MeOH (50:40:10 v/v/v) |
| 50mM Ammoniumacetat pH 5.5: Acetonitril (50:50 v/v) | |
| 50mM Ammoniumacetat pH 5.5: Acetonitril (30:70 v/v) | |
| 50mM Ammonium acetate pH 5.5: Acetonitril: EtOAC (50:40:10 v/v/v) | |
| Eluieren | 100mM NH4HCO3 (pH 10): Acetonitril: THF (50:40:10 v/v/v) |
| 100mM NH4HCO3 (pH 10): Acetonitril: THF (50:25:25 v/v/v) |
Durch eine entsprechende Optimierung Ihrer Oligo-Extraktion mit Clarity OTX ist es möglich, therapeutische Oligos und ihre Metaboliten effizient aus biologischen Proben zu reinigen. Dabei werden Zellbestandteile wie Proteine, genomische DNA und Lipide, die die interessierenden Oligo-Therapeutika erheblich verdecken können, effektiv entfernt. Durch die Entfernung dieser Verunreinigungen wird das MS-Basislinienrauschen erheblich reduziert, was zu einer einfacheren quantitativen Bioanalytik führt.
Wir hoffen, dieser Tipp war nützlich! Schauen Sie sich unseren Leitfaden unten an und sehen Sie sich nächsten Monat für einen weiteren Tipp!
Clarity OTX User's Guide for Extracting Oligo Therapeutics from Biological Samples
Umfassender Leitfaden für die Extraktion von Oligotherapeutika aus biologischen Proben.
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Clarity ist eine Marke von Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
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