Wskazówka techniczna dotycząca przygotowania próbki
Poziom: Zaawansowany
Analiza oligonukleotydów – przygotowanie próbki
Witamy ponownie w naszej comiesięcznej wskazówce technicznej! W tym miesiącu zajmiemy się tematem przygotowania próbek dla oligonukleotydów.
Oligonukleotydy są wysoce celowanymi związkami terapeutycznymi stosowanymi w leczeniu szerokiego zakresu stanów chorobowych. Podczas każdego procesu opracowywania leku należy ocenić farmakokinetykę środków terapeutycznych, w tym oligoterapeutyków. W przeciwieństwie do małych cząsteczek, związki oligo stanowią wyjątkowe wyzwanie.
Ekstrakcja oligonukleotydów z matryc biologicznych może być traktowana jako poszukiwanie przysłowiowej igły w stogu siana. Nawet stosunkowo „łatwe” matryce biologiczne, takie jak surowica, zawierają około 70 mg/ml białka, około 2 mg/ml lipidów w postaci lipoprotein, nie wspominając o znacznej ilości obecnych soli, kwasów organicznych i cukrów. Jeśli próbujemy wyizolować oligonukleotydy o zastosowaniu terapeutycznym w ilościach od piko- do mikrogramów/ml - nie jest to łatwe zadanie.
Tradycyjne metody ekstrakcji oligonukleotydów stosują proces dwustopniowy: (1) ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) jest używana do ekstrakcji oligonukleotydów do warstwy wodnej, z której następnie (2) izolowane są przy użyciu standardowego protokołu ekstrakcji na fazie stałej (SPE). Cały ten proces jest długotrwały i trudny do zautomatyzowania. Clarity™ OTX eliminuje potrzebę stosowania LLE, zmniejszając ryzyko powstawania emulsji i utraty próbki, a także zapewnia platformę, którą można zautomatyzować. Clarity OTX zapewnia dobry gotowy do użycia roztwór do ekstrakcji oligonukleotydów z próbek osocza i surowicy, a ogólny protokół przedstawiono na Rysunku 1.
| Wstępne Przygotowanie Próbki | |||
|---|---|---|---|
| Płyny biologiczne | Zmieszaj próbkę z buforem do lizy (1:1 lub 1:2) | ||
| Tkanka | 1. Przeprowadź trawienie proteinazą K lub homogenizację tkanki 2. Zmieszaj próbkę z buforem do lizy (1:1 lub 1:2) |
||
| Protokół SPE | |||
| Rozpuszczalnik / Bufor | Objętości | ||
| Krok | Płyta 96-dołkowa | 100 mg | 2 mg |
| Warunki | Metanol | 1 mL | 200 µL |
| Równoważenie | 50 mM Octan Amonu, pH 5.5
*Dla próbek tkankowych dodaj 0.5% TX-100, 0.1% cysteiny do powyższego buforu |
1 mL | 200 µL |
| Nanoszenie | Wstępnie przygotowana próbka | Do 0.5 mL | 100 µL |
| Przemywanie | 50 mM Octan Amonu, pH 5.5/ Acetonitryl (50:50) | 3x 1mL | 2-3 x 100 µL |
| Elucja | 100 mM Wodorowęglan Amonu, (pH 9.5) / Acetonitryl / Tetrahydrofuran (50:40:10) | 1mL | 2 x 75 µL |
Jednym z największych wyzwań są próbki zawierające tkanki. Podczas pracy z tego typu próbkami zaleca się dodanie niespecyficznej proteinazy K, która może poprawić aktywność enzymatyczną w warunkach denaturacji i w wysokiej temperaturze. Dobrą praktyką jest również dodanie na tym etapie ceramicznych kulek (ang. ceramic beads), aby ułatwić lizę obecnych tkanek. W przypadku takich próbek może być również konieczna optymalizacja etapów przemywania oraz elucji.
Wskazówki dotyczące optymalizacji metody:
W przypadku rozpuszczalników do przemywania, można badać różne dodatki organiczne, choć zawsze w połączeniu z buforowanym roztworem o pH 5.5, co jest kluczowe dla utrzymania oligonukleotydu na sorbencie, gdyż są one wiązane przez mechanizm wymiany jonowej. Zwiększenie zawartości organicznej lub użycie innego dodatku organicznego może pomóc w oczyszczaniu próbki poprzez bardziej efektywną elucję zanieczyszczeń utrzymywanych przez interakcje hydrofobowe. Zaleta stosowania wymiany jonowej do izolacji polega na tym, że można używać silniejszych rozpuszczalników do przemywania, o ile pH jest utrzymane.
W przypadku etapu elucji, poprawione odzyski można uzyskać przez zwiększenie pH roztworu eluenta i dostosowanie mieszanki używanych dodatków organicznych, utrzymując proporcję 50:50 buforu do zawartości organicznej. Sugestie dotyczące optymalizacji buforu do przemywania i elucji są podsumowane na Rysunku 2. Dodatkową wskazówką, aby zapobiec utlenianiu PS do PO podczas etapu elucji, jest dodanie TCEP do buforu eluenta.
| Krok | Modyfikacja |
|---|---|
| Przemywanie | 50 mM octan amonu pH 5,5: acetonitryl: MeOH (50:40:10 v/v/v) |
| 50 mM octan amonu pH 5,5: acetonitryl (50:50 v/v) | |
| 50 mM octan amonu pH 5,5: acetonitryl (30:70 v/v)) | |
| 50 mM octan amonu pH 5,5: acetonitryl: EtOAC (50:40:10 v/v/v) | |
| Elucja próbki | 100mM NH4HCO3 (pH 10): acetonitryl: THF (50:40:10 v/v/v) |
| 100mM NH4HCO3 (pH 10): acetonitryl: THF (50:25:25 v/v/v) |
Poprzez odpowiednią optymalizację ekstrakcji za pomocą Clarity OTX możliwe jest skuteczne oczyszczenie oligonukleotydów o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym i ich metabolitów z próbki biologicznej; skuteczne usuwanie pozostałości komórkowych takich jak białka, genomowe DNA i lipidy, które mogą znacząco maskować oligoterapeutyki będące przedmiotem zainteresowania. Usuwając te zanieczyszczenia, poziom szumu w detektorze MS jest znacznie niższy, dzięki czemu znacznie łatwiej przeprowazić ilościową bioanalizę.
Mamy nadzieję, że ta wskazówka była przydatna! Sprawdź nasz przewodnik poniżej i do zobaczenia w przyszłym miesiącu z kolejną wskazówką!
Przewodnik użytkownika Clarity OTX dotyczący ekstrakcji oligoterapeutyków z próbek biologicznych
Kompleksowy przewodnik instruktażowy dotyczący ekstrakcji oligoterapeutyków z próbek biologicznych.
Znaki Towarowe
Clarity jest znakiem towarowym Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
CONNECT WITH US
