Suggerimento Tecnico per la Preparazione del Campione
Livello: Avanzato
Preparazione del campione per analisi di oligonucleotidi
Bentornati alla nostra serie di suggerimenti mensili! Questo mese ci occuperemo della preparazione del campione per l'analisi di oligonucleotidi.
Gli oligonucleotidi sono agenti terapeutici altamente specifici utilizzati per trattare una vasta gamma di patologie. Durante qualsiasi processo di sviluppo del farmaco la farmacocinetica delle terapie deve essere valutata, tuttavia a differenza delle piccole molecole, gli oligo presentano alcune sfide uniche.
L'estrazione di oligonucleotidi da matrici biologiche può essere considerata come la ricerca del proverbiale ago in un pagliaio. Anche matrici biologiche relativamente "facili" come il siero contengono circa 70 mg/mL di proteine, circa 2 mg/mL di lipidi sotto forma di lipoproteine per non parlare della quantità significativa di sali, acidi organici e zuccheri presenti. Se stiamo cercando di isolare un oligonucleotide terapeutico a quantità da pico a microgrammo/mL, questo non è un compito facile.
I metodi per l'estrazione degli oligonucleotidi prevedono un processo in due fasi. La prima (1) è un'estrazione liquido-liquido (LLE) necessaria a portare gli oligonucleotidi in fase acquosa insieme ad altri componenti -idrosolubili- della matrice, mentre la seconda (2) è un’estrazione in fase solida (SPE) necessaria ad estrarre gli oligonucleotidi in maniera altamente selettiva. L'intero processo è lungo e difficile da automatizzare. Clarity™ OTX elimina la necessità di estrazione liquido-liquido e riduce la formazione di emulsioni, oltre a fornire una piattaforma che può essere automatizzata. Clarity OTX fornisce una buona soluzione per l'estrazione di oligonucleotidi da campioni di plasma e siero e il protocollo generico è mostrato nella Figura 1.
| Pre-Trattamento del Campione | |||
|---|---|---|---|
| Fluidi Biologici | Mescolare il campione con il “Lysis-Loading buffer” (1:1 o 1:2) | ||
| Tessuto | 1. Omogenizzare il tessuto o digerirlo con proteinasi K 2. Miscelare il campione con “Lysis-Loading buffer” (1:1 o 1:2) |
||
| Protocollo SPE | |||
| Solvente / Buffer | Volumi | ||
| Step | 96 Well Plate | 100 mg | 2 mg |
| Condizionamento | Metanolo | 1 mL | 200 µL |
| Equilibrazione | 50 mM Ammonio Acetato, pH 5.5
*Per campioni di tessuto aggiungere 0,5% TX-100 e 0,1% cisteine alle soluzioni citate sotto |
1 mL | 200 µL |
| Caricamento | Campione pre-trattato | Max 0.5 mL | 100 µL |
| Lavaggio | 50 mM Ammonio Acetato, pH 5.5/ Acetonitrile (50:50) | 3x 1mL | 2-3 x 100 µL |
| Eluizione | 100 mM Ammonio Acetato, (pH 9.5) / Acetonitrile / Tetraidrofurano (50:40:10) | 1mL | 2 x 75 µL |
Una delle grandi sfide sono i campioni di tessuto. Quando si lavora con campioni di tessuto si raccomanda l'aggiunta di Proteinasi K in quanto si tratta di una proteasi non specifica che può migliorare l'attività enzimatica in condizioni di denaturazione e calore. È anche buona pratica aggiungere "beads" di ceramica per favorire la lisi del tessuto. Con campioni di tessuto può anche essere necessaria una certa ottimizzazione delle fasi di lavaggio ed eluizione.
Suggerimenti per l’ottimizzazione del metodo:
É possibile esplorare diversi additivi organici quali solventi di lavaggio, ma sempre in combinazione con una soluzione tamponata a pH 5.5 che è fondamentale per favorire la ritenzione dell'oligonucleotide sulla fase stazionaria, in quanto il legame avviene attraverso un meccanismo di scambio ionico. L’ aumento della percentuale di organico o l'utilizzo di un solvente organico, diverso dall’acetonitrile, può aiutare ad incrementare la pulizia del campione favorendo l’eluizione dei contaminanti trattenuti da interazioni idrofobiche. Il vantaggio dell'utilizzo dello scambio ionico, per l'isolamento degli analiti è che possono essere utilizzati solventi di lavaggio più forti, purché il pH (5.5) della soluzione di lavaggio venga mantenuto.
Per provare ad aumentare il recupero degli analiti in fase di eluizione si può aumentare il pH della fase eluente e/o modificare la percentuale relativa di solventi organici, mantenendo però una proporzione di 50:50 tra tampone e fase organica. I suggerimenti per l'ottimizzazione dei tamponi di lavaggio e di eluizione sono riassunti nella Figura 2. Un ulteriore consiglio per prevenire l'ossidazione di PS a PO, durante la fase di eluizione, è aggiungere TCEP al tampone di eluizione.
| Step | Modifiche |
|---|---|
| Wash | 50mM Ammonio acetato pH 5.5: acetonitrile: MeOH (50:40:10 v/v/v) |
| 50mM Ammonio acetato pH 5.5: acetonitrile (50:50 v/v) | |
| 50mM Ammonio acetato pH 5.5: acetonitrile (30:70 v/v) | |
| 50mM Ammonio acetato pH 5.5: acetonitrile: EtOAC (50:40:10 v/v/v) | |
| Eluizione | 100mM NH4HCO3 (pH 10): acetonitrile: THF (50:40:10 v/v/v) |
| 100mM NH4HCO3 (pH 10): acetonitrile: THF (50:25:25 v/v/v) |
Attraverso un'adeguata ottimizzazione dell'estrazione dell'oligo utilizzando Clarity OTX è possibile ripulire in modo efficiente gli oligo terapeutici e i loro metaboliti dal campione biologico; rimuovere efficacemente i detriti cellulari come proteine, DNA genomico e lipidi che possono mascherare significativamente le terapie oligo di interesse. Rimuovendo questi contaminanti, il rumore di fondo in MS è notevolmente ridotto con conseguente miglioramento dell’analisi quantitativa.
Speriamo che questo suggerimento ti sia stato utile! Dai un'occhiata alla guida qui sotto e al prossimo mese con un nuovo suggerimento!
Clarity OTX per l'Estrazione di Oligonucleotidi da Campioni Biologici
Guida completa all'estrazione di oligonucleotidi da campioni biologici.
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