Suggerimento Tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Intermedio
Approccio sistematico allo screening e sviluppo
metodo Chirale
Come posso selezionare una fase stazionaria chirale appropriata?
Considerata la struttura dell'analita, come posso scegliere quale colonna utilizzare?
Mi serve una colonna chirale da utilizzare in fase inversa per separare il mio composto?
La separazione cromatografica avviene grazie alla combinazione dell'ambiente che si crea tra fase stazionaria e fase mobile, le forze che si instaurano permettono di discriminare analiti con proprietà chimiche differenti. In fase inversa, ad esempio, il principale meccanismo di interazione con la fase stazionaria è idrofobico, per cui gli analiti usciranno in ordine di idrofobicità crescente. Gli enantiomeri hanno le stesse proprietà chimico-fisiche ed è per questo motivo che per ottenere la separazione è necessario che i due enantiomeri istaurino differenti interazioni (dettate dal selettore chirale) con la fase stazionaria.
La separazione in cromatografia chirale avviene grazie alla formazione di un diasteroisomero, o tra l'analita e un modificante chirale nella fase mobile, o tra l'analita e la fase stazionaria. Una volta formato è possibile separare gli enantiomeri, sia perché il complesso diastereomerico ha proprietà diverse, sia per la stabilità del complesso formato. L'utilizzo di modificanti chirali nella fase mobile non è comunemente utilizzato in HPLC per l'alto costo il costo di tali sostanze, che rende la soluzione inapplicabile nella maggior parte dei casi (anche se largamente utilizzato in elettroforesi capillare). Esistono diverse tipologie di fasi chirali tra le quali:
• Fasi Pirkle. Fasi sintetiche basate su aminoacidi funzionalizzati che offrono 3 punti di interazione permettendo la selettività chirale. I selettori chirali sono chimicamente legati, caratteristica che gli conferisce una buona resistenza. Generalmente questo tipo di fase chirale è molto specifica.
• Fasi basate sulle ciclodestrine. Sono fasi sintetiche legate che si basano sul principio di esclusione: solo uno dei due enantiomeri sarà in grado di interagire in maniera efficace con la "tasca chirale".
• Fasi basate sulle proteine. La silice viene rivestita con proteine, come la BSA, che offrono un ampia gamma di interazioni chirali. La risoluzione è inferiore se comparata con fasi Pirkle o ciclodestriniche, ma la selettività è più ampia. Necessitano di attenzioni particolari nell'utilizzo per evitare di rovinare o eluire lo strato di proteine che riveste la silice.
• Scambio di ligando. Il meccanismo di scambio è abbastanza specifico e legato alla combinazione di penicilammina e dell'accoppiante ionico contenuto nella fase mobile. Il legame che si instaura tra ioni e aminoacidi permette la separazione.
• Fasi stazionarie a base di polisaccaride. Sono basate sui polimeri chirali naturali come cellulosa o amilosio, che sono derivatizzati per fornire ulteriori interazioni. A seconda dei solventi utilizzati, i polimeri si "rigonfiano" diversamente, creando "tasche chirali" all'interno delle quali gli analiti entrano ed escono separandosi. Recenti sviluppi di questa tecnologia prevedono l'immobilizzazione di tali fasi per consentire l'utilizzo di una gamma più ampia di solventi rispetto a quanto si potesse fare in precedenza. Sulla fasi immbolizzate si possono usare solventi come DMSO e DMF, che sono molto utili in HPLC preparativa quando la solubilità dell'analita è limitata.
Data la flessibilità di utilizzo dalle fasi polisaccaridiche, che consentono separazioni in fase normale, fase inversa, polar organic e SFC con elevata efficienza, queste fasi sono diventate la scelta primaria per gli utenti coinvolti in separazioni chirali. Le polisaccaridiche offrono alti tassi di successo, aumentando la probabilità di trovare le condizioni analitiche per la separazione chirale. A causa della complessa natura delle interazioni tra enantiomeri e la fase stazionaria chirale, non è possibile prevedere con precisione quale fase stazionaria fornirà una buona separazione. È quindi necessario vagliare diverse condizioni di fase stazionaria e fase mobile al fine di trovare la migliore. Per lo screening chirale su Lux, consigliamo di esplorare le tre modalità di interazione (fase normale, fase inversa e polar organic) in tandem. Le colonne Lux possono anche essere utilizzate con successo in condizioni SFC. Esaminiamo le seguenti fasi:
Lo screening può anche essere eseguito anche in condizioni compatibili con LC-MS.
Una volta completato lo screening si valuteranno i risultati ottenuti, scegliendo i più promettenti che saranno usati nella successiva fase di ottimizzazione del metodo. Questo approccio è universalmente riconosciuto come il più efficace per sviluppare separazioni chirali con una buona risoluzione e robustezza.
Poster Lux per Screening Chirale
Strategie di screening semplificate per colonne HPLC/SFC Chirali: fase normale, fase organica polare e fase inversa
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