Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : intermédiaire
Une approche systématique du screening chiral et du développement de méthodes
"Comment sélectionner la phase stationnaire chirale adéquate pour mon composé d'intérêt" ;
"Comment déterminer la colonne à privilégier en fonction structure de l'analyte" ;
"J'ai besoin d'une colonne chirale de phase inverse pour séparer X".
Les séparations chromatographiques résultent de l'expression de la sélectivité entre 2 molécules de propriétés physico-chimiques différentes, grâce à la combinaison d'une phase stationnaire et d'une phase mobile créant un environnement favorable. Dans l'exemple de la chromatographie en phase inverse, les analytes sont retenus par des intéractions hydrophobes et éluent suivant leur degré d'hydrophobicité croissant. Dans le cas d'énantiomères, les propriétés chimiques et physiques sont identiques. Une forme de reconnaissance chirale est donc nécessaire pour obtenir une séparation.
Les séparations chirales impliquent la formation d'un complexe diastéréomérique, soit entre un additif dans la phase mobile et l'analyte cible, soit entre la phase stationnaire et l'analyte. Une fois formé, il est possible de séparer les énantiomères, soit car le complexe diastéréomérique a des propriétés différentes, soit en raison de la stabilité du complexe formé, un énantiomère étant plus retenu que l'autre. L'utilisation de modificateurs chiraux dans la phase mobile, bien que possible, n'est pas fréquente en HPLC (toutefois utilisée dans l'électrophorèse capillaire) car le coût de ces additifs rend cette option le plus souvent trop onéreuse. Parmi les types de phases stationnaires chirales utilisées au fil des ans, on peut citer :
• Phases Pirkle. Ces phases entièrement synthétiques reposent sur des acides aminés fonctionnalisés. Elles permettent une reconnaissance chirale en offrant 3 points d'interaction. Les matériaux sont généralement liés de manière covalente à la hase stationnaire, apportant une bonne robustesse. Ce type de phase très spécifique présente généralement moins de séparatuions d'énantiomères mais offre une bonne sélectivité lorsque la séparation réussit.
• Phases à base de cyclodextrine. Ces phases liées entièrement synthétiques fonctionnent selon un principe d'exclusion, un énantiomère pouvant s'insérer plus spécifiquement que l'autre dans la structure de la "cage chirale".
• Phases à base de protéines. Les protéines telles que la BSA vont être déposées sur la silice. Elles offrent une plus large gamme d'interactions chirales. La résolution n'est probablement pas aussi importante qu'avec des phases Pirkle ou des cyclodextrines mais ces colonnes offrent une plus large gamme de sélectivités. Un soin particulier doit être apporté à ces colonnes au niveau de certaines températures et de compositions de phases mobiles pouvant dénaturer les protéines, les décrocher du support ou encore altérer les propriétés de la phase stationnaire de manière générale.
• Échange de ligands. Le mécanisme d'échange de ligands utilise la pénicillamine en combinaison avec une phase mobile contenant des ions de cuivre II d'une manière assez spécifique. Les ions forment des complexes avec les acides aminés, ce qui permet de les séparer.
• Les phases stationnaires avec des polysaccharides. Celles-ci sont basées sur les polymères chiraux naturels : la cellulose ou l'amylose. Les polymères sont dérivatisés pour fournir des interactions supplémentaires. En fonction des solvants utilisés, les polymères gonflent à des degrés différents, créant des "poches chirales" dans la structure, permettant aux analytes de se répartir à l'intérieur et à l'extérieur de la structure et d'accomplir une séparation. Parmi les développements récents, on peut citer l'immobilisation de ces phases (liaison covalente entre le polysaccharide et la silice), ce qui permet d'utiliser une gamme de solvants plus large que sur les phases dites "déposées". Des solvants tels que le DMSO et le DMF peuvent être utilisés, utiles quand l'analyte n'est soluble que dans ces solvants.
Les phases à base de polysaccharides fournissent des séparations à haute performances aussi bien en phase normale, phase inverse, organique polaire, qu'en SFC. Grâce à cette flexibilité, ces phases sont les plus privilégiées par les analystes de composés chiraux. Elles offrent des taux de réussite élevés qui, à leur tour, augmentent la probabilité de trouver un ensemble de conditions qui permettront une séparation efficace. En raison de la nature complexe des interactions entre les énantiomères et une phase stationnaire chirale, il n'est pas possible de prédire avec précision quelle phase stationnaire fournira la bonne séparation. Il est donc nécessaire passer au crible différentes compositions de phases stationnaires et de phases mobiles pour obtenir la meilleure combinaison pour la séparation. Lors du screening de notre gamme de phases à base de polysaccharides, Lux, nous testons 3 modes : phase normale, phase inverse et mode organique polaire en tandem. Les colonnes Lux peuvent également être utilisées avec succès dans des conditions de SFC si les utilisateurs ont accès à cette technologie. Nous testons les phases suivantes :
Le screening peut également être effectué dans des conditions favorables à la LC-MS si cela est nécessaire. Des détails précis sont disponibles sur le poster de screening chiral ci-dessous.
Une fois le screening terminé, il est alors nécessaire d'examiner les résultats obtenus, en prenant les plus prometteurs pour les optimiser si nécessaire. Cette méthode s'est avérée être la plus efficace pour développer des séparations chirales résolutives et robustes.
Poster de screening chiral
Phases chirales immobilisées - Phases chirales déposées - Conditions de phase inverse, normale, organique polaire et SFC
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Lux appartient à Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
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