Jak sprawdzić, czy kolumna HPLC została prawidłowo przygotowana do analizy?

W przypadku stosowania kolumny w trybie gradientowym, po skończonym gradiencie występuje okres, w którym kolumna musi zostać ponownie przygotowana do następnej analizy. W tym czasie ważne jest, aby kolumna była kondycjonowana z powrotem do warunków początkowych metody gradientowej (ten etap procesu znany jest jako ponowna stabilizacja lub t_eq).

Aby zapewnić pełną ponowną stabilizację, ważne jest uwzględnienie w cyklu gradientu czasów opóźnienia gradientu dla objętości opóźnienia gradientu (dwell volume) oraz czasu potrzebnego na dotarcie rozpuszczalnika do kolumny. Na rys. 1 pokazano, jak może wyglądać opóźnienie gradientu dla danej metody.

Opis do rys. 1
A. Zaprogramowany skład fazy ruchomej
B. Realny skład fazy ruchomej w kolumnie

Czas wymagany do całkowitej ponownej stabilizacji kolumny zależy w dużym stopniu od warunków metody, wymiarów kolumny oraz w pewnym stopniu od czułości metody. Niektóre związki są bardziej podatne na niewielkie zmiany w składzie fazy ruchomej niż inne. W celu uzyskania pełnej ponownej stabilizacji często zaleca się, aby przepłukać kolumnę 10-cioma objętościami kolumny, jednakże w praktyce zwykle wystarcza 1–2. Jednym z najlepszych sposobów zapewnienia ponownej stabilizacji kolumny jest śledzenie ciśnienia w danej metodzie. W miarę zwiększania udziału rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej ciśnienie będzie się zmieniało. To, czy wzrośnie czy spadnie, zależy od doboru rozpuszczalnika, jednak po powrocie do pierwotnego ciśnienia początkowego podczas cyklu ponownej stabilizacji, można określić odpowiedni czas potrzebny do osiągnięcia pełnej ponownej stabilizacji (rys. 2).

Opis do rys. 2
A. Pierwotne ciśnienie wsteczne
B. Stabilny powrót do pierwotnego ciśnienia wstecznego