Quanto tempo dopo la fine del gradiente, è possibile iniettare nuovamente?
Quando si effettua un’analisi in gradiente è necessario preparare la colonna per le iniezioni sucessive. La colonna, in questo lasso di tempo, viene riportata alle condizioni iniziali del metodo in gradiente (questo passaggio del processo è noto come riequilibratura o teq)
Per garantire una riequilibratura completa, è importante tenere in considerazione anche i tempi di ritardo del gradiente (Dwell strumentale). In questo modo è possibile stimare il tempo necessario affinché il solvente raggiunga la colonna, ottimizzando i tempi di contatto tra solvente e fase stazionaria. La Fig. 1 mostra come potrebbe apparire il ritardo del gradiente in uno specifico metodo.
Legenda della Fig. 1
A. Composizione della fase mobile programmata
B. Composizione della fase mobile della colonna
La colonna è perfettamente riequilibrata quando l’aumento del tempo di equilibratura non influisce più sul tempo di ritenzione degli analiti separati in 2 corse consecutive.
Il tempo necessario per riequilibrare completamente una colonna dipenderà fortemente dalle condizioni del metodo, dalle dimensioni della colonna e, in una certa misura, dalla sensibilità del metodo. Alcuni composti sono più soggetti a lievi cambiamenti nella composizione della fase mobile rispetto ad altri. In teoria la riequilibratura è completa quando in colonna sono passati 10 volumi di colonna, tuttavia nella pratica sono generalmente sufficienti 1-2 volumi. Uno dei modi migliori per garantire la riequilibratura della colonna è analizzare la variazione di pressione del metodo. La pressione inizierà a fluttuare man mano che la proporzione di solvente organico nella fase mobile aumenta. L’aumento o la riduzione della pressione dipenderà dal solvente utilizzato come fase mobile. Tuttavia, basterà assicurarsi che la pressione ritorni ai valori iniziali prima di procedere con le analisi successive. In questo modo, è possibile determinare il tempo necessario ad ottenere la completa riequilibratura della colonna (Fig. 2).
Legenda della Fig. 2
A. Contropressione originale
B. Ritorno stabile alla contropressione originale
Quando si considerano i tempi di riequilibratura, gli analiti meno trattenuti dalla fase stazionaria sono quelli maggiormente influenzati. Se sono presenti picchi che eluiscono all’inizio del gradiente, il ciclo di riequilibratura dovrà essere più lungo rispetto a quelle applicazioni in cui i picchi eluiscono più tardi.
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