Après une méthode utilisant un gradient d’élution, quel temps de rééquilibration appliquer ?
Lorsqu’une colonne est utilisée en mode gradient, il y a à la fin du gradient un délai pendant lequel la colonne doit être préparée de nouveau pour la prochaine analyse. Pendant ce délai, il est important que la colonne soit reconditionnée dans les conditions de départ de la méthode du gradient (cette étape est appelée ré-équilibration ou teq)
Pour assurer une rééquilibration complète, il est important de prendre en compte le temps de retard du gradient dans votre cycle de gradient afin de tenir compte du volume mort du système et du délai nécessaire pour que le solvant atteigne la colonne. La figure 1 montre à quoi le retard de gradient pourrait ressembler pour une méthode HPLC.
Vers la fig. 1
A. Composition de la phase mobile programmée
B. Composition de la phase mobile sur la colonne
La rééquilibration est terminée lorsque l'augmentation du temps de rééquilibration n’affecte pas le temps de rétention des analytes séparés durant l’analyse suivante.
Le délai nécessaire pour rééquilibrer entièrement une colonne dépendra fortement des conditions de votre méthode, des dimensions de la colonne et, dans une certaine mesure, de la sensibilité de la méthode. Certains composés sont plus sensibles que d'autres à des changements légers dans la composition de la phase mobile. Pour obtenir une rééquilibration complète, il est souvent recommandé d’utiliser 10 volumes de colonne, mais en pratique, un ou deux s’avèrent généralement suffisants. L'un des meilleurs moyens d'assurer la rééquilibration de la colonne consiste à suivre l’enregistrement de la pression de votre méthode. À mesure que vous augmenterez la proportion de solvant organique dans votre phase mobile, votre pression fluctuera. Son augmentation ou sa diminution dépendra des solvants choisis. Cependant, en recherchant un retour à vos conditions initiales de pression pendant le cycle de rééquilibration, vous pouvez déterminer la durée appropriée nécessaire pour obtenir une rééquilibration complète. (Fig. 2).
Voir la figure 2
A. Contre-pression initiale
B Retour stable vers la contre-pression initiale
Les pics éluant les premiers sont davantage affectés par les temps de rééquilibration qui sont appliqués. Si vous avez des pics éluant tôt dans votre gradient, votre cycle de rééquilibration devra être plus long que celui utilisé pour des méthodes où les pics éluent plus tard.
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