Cómo saber si su columna HPLC se ha reequilibrado

Cuando utilizamos una columna en modo gradiente, hay un período de tiempo al final del gradiente en el que se tiene que volver a equilibrar la columna para el siguiente análisis. En este tiempo es importante que la columna vuelva a las condiciones iniciales del método en gradiente (este paso del proceso se conoce como reequilibrio o t_eq)

Para garantizar un reequilibrio completo, es importante considerar los tiempos de retardo del gradiente en su ciclo de gradiente para tener en cuenta el volumen de actuación del sistema y el tiempo que se necesita para que el disolvente alcance la columna. En la figura 1 se muestra cómo sería el retardo del gradiente en un método determinado.

Índice Fig. 1
A. Composición de la fase móvil programada
B. Composición de la fase móvil que experimenta la columna

El tiempo que se necesita para reequilibrar completamente una columna dependerá en gran parte de las condiciones de su método, las dimensiones de la columna y, en cierto punto, de la sensibilidad del método. Algunos compuestos son más susceptibles a pequeños cambios en la composición de la fase móvil que otros. Para un reequilibrio completo, se suele recomendar requerir 10 volúmenes de columna, mientras que en la práctica con 1 o 2 es suficiente. Una de las mejores formas de garantizar el equilibrado de la columna es atender a los valores de presión de su método. A medida que se incrementa la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil, la presión fluctuará. Si aumenta o disminuye dependerá de las elecciones de disolvente, mientras que, si se busca volver a la presión original durante el ciclo de reequilibrio, podrá determinar el período de tiempo adecuado que se necesita para conseguir un reequilibrio total (Fig. 2).

Índice Fig. 2
A. Contrapresión original
B. Vuelta estable a la contrapresión original