Wie lange ist die Re-Äquilibrierung nach der Gradientenelution zu wählen?
Bei der Verwendung einer Säule im Gradientenmodus gibt es am Ende des Gradienten eine Zeitspanne, in der die Säule für die nächste Analyse vorbereitet werden muss. Während dieser Zeit ist es wichtig, dass die Säule wieder auf die Ausgangsbedingungen der Gradientenmethode konditioniert wird (dieser Verfahrensschritt wird als Re-Äquilibrierung oder teq bezeichnet).
Um eine vollständige Re-Äquilibrierung zu gewährleisten, ist es wichtig, Gradientenverzögerungszeiten in den Gradientenzyklus einzubeziehen, um das Verweilvolumen des Systems und die Zeit zu berücksichtigen, die das Lösungsmittel benötigt, um die Säule zu erreichen. Abb. 1 zeigt, wie die Gradientenverzögerung für eine bestimmte Methode aussehen könnte.
Legende zu Abb. 1
A. Programmierte Zusammensetzung der mobilen Phase
B. Zusammensetzung der mobilen Phase, die durch die Säule fließt
Die Re-Äquilibrierung ist abgeschlossen, wenn eine Verlängerung der Äquilibrierzeit die Retentionszeit der im nachfolgenden Gradientenlauf getrennten Analyten nicht beeinflusst.
Die Zeit, die für die vollständige Re-Äquilibrierung einer Säule benötigt wird, hängt stark von den Methodenbedingungen, den Säulenabmessungen und bis zu einem gewissen Grad von der Empfindlichkeit der Methode ab. Einige Verbindungen reagieren empfindlicher auf geringfügige Änderungen der Zusammensetzung der mobilen Phase als andere. Für eine vollständige Re-Äquilibrierung werden häufig zehn Säulenvolumina empfohlen, in der Praxis reichen jedoch in der Regel zwei bis drei aus. Eine der besten Möglichkeiten, die Re-Äquilibrierung der Säule sicherzustellen, ist die Betrachtung der Druckkurve Ihrer Methode. Wenn Sie den Anteil des organischen Lösungsmittels in Ihrer mobilen Phase erhöhen, schwankt Ihr Druck. Ob sie zunimmt oder abnimmt, hängt von der Wahl des Lösungsmittels ab, wenn Sie jedoch darauf achten, dass der ursprüngliche Ausgangsdruck während des Re-Äquilibrierzyklus wieder erreicht wird, können Sie die angemessene Zeitspanne bestimmen, die für eine vollständige Re-Äquilibrierung erforderlich ist (Abb. 2).
Legende zu Abb. 2
A. Ursprünglicher Rückdruck
B. Stabile Rückkehr zum ursprünglichen Rückdruck
Bei der Betrachtung der Re-Äquilibrierzeiten sind die frühen Peaks stärker betroffen. Wenn Sie Peaks haben, die früh in Ihrem Gradienten eluieren, muss Ihr Re-Äquilibrierzyklus länger sein als bei Anwendungen, bei denen die Peaks später eluieren.
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