Überblick: Die Analyse von modernen Arzneimittelkandidaten birgt viele chromatographische Herausforderungen, sei es die Detektion oder die Auflösung von miteluierenden Verunreinigungen. Aber eine der häufigsten Schwierigkeiten ist die Retention und Auflösung von polaren Verbindungen, die unter typischen C18-Umkehrphasenbedingungen nicht festgehalten werden.
Viele herkömmliche Umkehrphasen-HPLC-Säulen bieten keine adäquate Retention für viele der immer zahlreicher werdenden polaren Verbindungen, die mittels HPLC analysiert werden. Diese Verbindungen eluieren entweder im Totvolumen der Säule oder sie werden so schlecht retiniert, dass ihre Peakform beeinträchtigt wird. Oft eluieren sie auch zusammen mit anderen schlecht zurückgehaltenen Substanzen. Frühe Peaks eluieren auch häufig in der primären Ionensuppressionszone, die für Anwender von LC-MS-Geräten problematisch ist.
In diesem technischen Tipp wird HILIC als alternativer Ansatz vorgestellt, der besonders effektiv für LC-MS ist. HILIC verwendet hohe Mengen an organischem Lösungsmittel, um die polaren Verbindungen zu retinieren, was dazu beiträgt, ihre Ionisierungseffizienz während der LC-MS zu verbessern.
Tipp: HILIC funktioniert, indem polare Verbindungen in einer wasserreichen Schicht zurückgehalten werden, die sich bei einer polaren stationären Phase an der Oberfläche der Silikapartikel bildet (Abb. 1)
Acetonitril (ACN) ist das schwache Lösungsmittel bei HILIC und ein Ammoniumpuffer das starke Lösungsmittel. Ammoniumsalze sind als Gegenion entscheidend, da sie die Bildung der für die Trennung kritischen Doppelschicht erleichtern, wie in Abb. 1 gezeigt.
Eine polare stationäre Phase zieht eine wasserreiche Schicht an ihre Oberfläche, die die Retention von polaren Verbindungen an der stationären Phase fördert. Polare Verbindungen werden eluiert, wenn Sie den Wasseranteil in der mobilen Phase erhöhen, was die Retention der polaren Analyten an der polaren stationären Phase unterbricht, um die Elution einzuleiten.
Es ist wichtig, dass Sie Ihre HILIC-Säule vor der Verwendung vollständig äquilibrieren, um sicherzustellen, so dass genügend Zeit zur Ausbildung dieser wasserreichen Schicht bestand. Wenn dies nicht der Fall ist, werden Sie keine gleichbleibende Retention Ihrer Verbindung sehen, was zu einer geringen Robustheit Ihrer Methode führt.
Wir haben die Verwendung von Ammoniumpuffern erwähnt, und es gibt mehrere andere Faktoren innerhalb einer HILIC-Methode, die ebenfalls entscheidend für den Erfolg sind.
Der erste ist die passende Selektivität, für die die richtige Säule der Schlüssel ist. Wie bei Reversed-Phase-Säulen gibt es auch für die HILIC-Chromatographie viele verschiedene stationäre Phasen, die jeweils unterschiedliche Selektivitätsprofile und Vorteile bieten. Wir empfehlen, dass Sie immer versuchen, 3 Phasen mit unterschiedlicher Chemie zu screenen, um festzustellen, welche die beste Selektivität für Ihre Anwendung bietet.
Folgende Typen von HILIC-Phasen können Sie in Betracht ziehen
- underivatisiertes Siliziumdioxid wie z. B. Kinetex HILIC
- Diolphasen wie Luna HILIC
- NH2 Phasen
- ionische / zwitterionische Phasen
Das Gradientenprofil sollte nach Möglichkeit 90% ACN - 50% betragen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Doppelschicht zu Beginn des Gradienten vollständig äquilibriert ist. Wenn Bedingungen mit mehr als 50 % Puffer erforderlich sind, um die Verbindung zu eluieren, ist HILIC wahrscheinlich nicht die am besten geeignetste Methode und z.B. eine polar-funktionalisierte C18-Phase könnte eventuell eine bessere Option darstellen. Sie müssen die Doppelschicht nach jedem Gradientenlauf neu äquilibrieren. Je höher der Wasseranteil am Ende des Gradienten ist, desto länger dauert dieser Re-Äquilibrierungsprozess. Eine unvollständige Re-Äquilibrierung der Säule führt zu einer schlechten Reproduzierbarkeit und zu einem Mangel an Robustheit der Methode.
Der letzte Parameter, den Sie sorgfältig berücksichtigen sollten, ist der pH-Wert. Es sollten mindestens 2 verschiedene pH-Werte untersucht werden, wobei wir in der Regel pH 3,2 bei Verwendung von Ammoniumformiat und 5,8 bei Verwendung von Ammoniumacetat vorschlagen. Unterschiedliche pH-Werte können zu einer deutlich unterschiedlichen Selektivität führen (Abb. 2).
Deutliche Änderungen in der Elutionsreihenfolge durch die Art der Säulenchemie und die Bedingungen der mobilen Phase
HILIC ist ein äußerst nützliches Werkzeug, um die Retention von polaren Verbindungen zu verbessern. Die Robustheit dieser Technik zu gewährleisten kann eine anspruchsvolle Aufgabe sein, aber eine sorgfältige Auswahl der mobilen Phase und der Methodenparameter kann zu erfolgreichen Trennungen für anspruchsvolle Verbindungen führen.