Métodos analíticos de ingeniería exitosos usando HILIC como un mecanismo de retención alternativo

Consejo técnico de HPLC / UHPLC

Resumen: Las drogas candidatas modernas presentan muchos desafíos cromatográficos, ya sea en la detección o bien en la resolución de una impureza coadyuvante, pero una de las dificultades más comunes es la retención y resolución de compuestos polares que no son susceptibles de ser analizadas por las condiciones típicas de fase reversa del sorbente C18.

Muchas de las fases estacionarias tradicionales de fase reversa no proporcionan una retención adecuada de muchos de los cada vez más numerosos compuestos polares analizados por HPLC. Estos compuestos a menudo no son retenidos en el volumen muerto de la columna, se retienen tan pobremente que su forma de pico se ve comprometida, o coeluyen con otros picos mal retenidos. Los picos que se eluyen tempranamente también lo hacen en una zona de supresión de iones que es problemática para las personas que utilizan instrumentos de LC-MS.

Este consejo técnico esbozará el método HILIC como un enfoque alternativo que es particularmente efectivo para LC-MS. HILIC usa altos niveles de solvente orgánico para eluir los compuestos polares, lo que ayuda a mejorar su eficacia de ionización durante el análisis por LC-MS.

Consejo: HILIC funciona reteniendo los compuestos polares en una capa rica en agua que se forma en la superficie de la partícula de sílice como resultado de una fase estacionaria polar (Fig. 1)

Fig 1.

Consejo: HILIC funciona reteniendo los compuestos polares en una capa rica en agua que se forma en la superficie de la partícula de sílice como resultado de una fase estacionaria polar (Fig. 1).

El acetonitrilo (MeCN) es el disolvente débil durante el método HILIC y un amortiguador de amonio el disolvente fuerte. Las sales de amonio son críticas como contra-ión, ya que facilitan la formación de la bicapa crítica para la separación demostrada en la Fig 1.

Es importante que equilibre completamente su columna HILIC antes de usarla para asegurar de que esta capa rica en agua ha tenido el tiempo necesario para formarse. Si esto no ha ocurrido, entonces no verá una retención consistente de su compuesto o la robustez de su método.

Hemos mencionado el uso de tampones de amonio, y hay varios otros factores dentro de un método HILIC que también son críticos para su éxito.

El primero es la selectividad, para la cual la columna correcta es clave. Al igual que con las columnas de fase reversa, hay muchas fases estacionarias diferentes para la cromatografía HILIC y cada una ofrece diferentes perfiles de selectividad y beneficios. Le recomendamos que siempre se esfuerce por examinar 3 fases diferentes para determinar cuál ofrece la mejor selectividad para su aplicación.

Los tipos de fases estacionarias de HILIC que podría considerar incluyen:

En cuanto a la fase móvil, es importante utilizar el MeCN como componente orgánico, ya que los disolventes próticos como el metanol interrumpirán esta formación de dos capas de la que hablamos. La cantidad de orgánico también es importante. Un porcentaje demasiado alto de orgánico en el punto inicial del gradiente complicará y prolongará el equilibrio de la bicapa; el 90% de orgánico es ideal para las condiciones iniciales del método.

El perfil del gradiente debe ser 90% MeCN - 50% cuando sea posible. Esto asegura que la bicapa esté completamente equilibrada al comienzo del gradiente. Si se requieren condiciones con un buffer superior al 50% para eluir el compuesto, es probable que el método no sea el más adecuado para el HILIC, y un tipo de fase estacionaria polar C18 podría ser una mejor opción. Será necesario reequilibrar la bicapa después de cada gradiente. Cuanto más alto sea el porcentaje de amortiguamiento al final del gradiente, más tiempo llevará este proceso de re-equilibrio. Una reequilibración incompleta del tampón llevará a una pobre reproducibilidad y a una falta de robustez del método.

El último parámetro que debe considerarse cuidadosamente es el pH. Al menos 2 pH diferentes deberían ser examinados, y normalmente sugeriríamos un pH de 3,2 utilizando el formato de amonio y 5,8 utilizando el acetato de amonio. Diferentes pH pueden llevar a selectividades significativamente diferentes (Fig. 2).

Fig 2.

Los grandes cambios en el orden de elución entre la química de la columna y las condiciones de la fase móvil

HILIC es una herramienta extremadamente útil para mejorar la retención de los compuestos polares. La técnica puede ser un enfoque difícil con el que construir la robustez, pero las elecciones cuidadosas de la fase móvil y los parámetros del método pueden llevar a separaciones exitosas para compuestos difíciles.