Mise au point de méthodes analytiques efficaces utilisant la méthode HILIC comme mécanisme de rétention alternatif

Aperçu : Les candidats médicaments modernes présentent de nombreux défis sur le plan chromatographique, qu'il s'agisse de la détection ou de la résolution d'une impureté pouvant coéluer. L'une des difficultés les plus courantes est la rétention et la résolution de composés polaires qui ne se prêtent pas aux conditions typiques de la phase inverse sur colonne C18.

De nombreuses phases stationnaires traditionnelles en HPLC phase inverse ne fournissent pas une rétention adéquate d’un nombre toujours plus importants de composés polaires. Ces composés sont : soit non retenus dans la colonne, soit retenus si faiblement que la forme de leur pic est compromise, soit coélués avec d'autres pics mal retenus. Les pics à élution précoce éluent également dans une zone de suppression d'ions qui est problématique pour les utilisateurs de la LC-MS.

Cette astuce technique présente le mode HILIC comme une approche alternative à la phase inverse, notamment en LC-MS. Le mode HILIC permet la rétention et l’élution de composés polaires, et utilise des niveaux élevés de solvant organique dans la phase mobile, ce qui permet d'améliorer l’efficacité d'ionisation lors de l’analyse en LC-MS.

Astuce : le mode HILIC fonctionne en retenant les composés polaires dans une couche riche en eau qui se forme à la surface de la particule de silice grâce à la phase stationnaire polaire (Fig. 1)

Fig 1.

L'acétonitrile (MeCN) est le solvant faible en mode HILIC alors qu’un tampon ammonium est le solvant fort. Les sels d'ammonium sont essentiels en tant que contre-ions car ils facilitent la formation de la bicouche indispensable à la séparation, comme le montre la figure 1.

Une phase stationnaire hautement polaire attire une couche riche en eau à sa surface, ce qui favorise la rétention des composés polaires dans la phase stationnaire. Les composés polaires sont élués lorsque l'on augmente la quantité d'eau dans la phase mobile de la colonne, ce qui entraîne une perturbation de la rétention des analytes polaires au sein de la phase stationnaire polaire pour provoquer l'élution.

Il est important que vous équilibriez complètement votre colonne HILIC avant de l'utiliser pour vous assurer que cette couche riche en eau ait eu le temps de se former. Si ce n'est pas le cas, vous n'obtiendrez pas une rétention constante de votre composé ni une méthode robuste.

En plus de l’utilisation des tampons ammonium mentionnée ci-dessus, il existe d’autres facteurs essentiels à la réussite d’une méthode HILIC.

Le premier facteur est la sélectivité, aussi le choix de la colonne joue un rôle fondamental. Comme pour les colonnes en phase inverse, il y a de nombreuses phases stationnaires pour la chromatographie HILIC et elles offrent toutes des profils de sélectivité et des avantages différents. Nous vous recommandons de toujours essayer de tester 3 chimies de phases pour déterminer celle qui fournit la meilleure sélectivité pour votre application.

Les types de phases stationnaires HILIC que vous pouvez prendre en considération incluent :

En ce qui concerne la phase mobile, il est important d'utiliser du MeCN comme solvant organique - les solvants protiques tels que le méthanol perturberont la formation de la bicouche dont nous avons parlé. La quantité de solvant organique joue également un rôle important. Un pourcentage organique trop élevé au début du gradient initial compliquera et prolongera le temps d’équilibration ; un pourcentage de 90% de solvant organique est idéal en conditions initiales.

Le profil du gradient doit être si possible 90% MeCN - 50%. Cela garantit que la colonne est complètement équilibrée au début du gradient. Si des conditions supérieures à 50 % de tampon sont nécessaires pour éluer le composé, il est probable que la méthode ne soit pas adaptée au mode HILIC et qu'une phase stationnaire polaire de type C18 soit une meilleure option. Vous devrez rééquilibrer la colonne après chaque cycle de gradient. Plus le pourcentage de tampon est élevé à la fin du gradient, plus le processus de rééquilibrage sera long. Une rééquilibration incomplète du tampon entraînera une mauvaise reproductibilité et un manque de robustesse de la méthode.

Le dernier paramètre à considérer avec attention est le pH. Il faut tester au moins deux pH différents ; nous suggérons généralement un pH de 3,2 avec un tampon formiate d'ammonium et un pH de 5,8 avec un tampon acétate d'ammonium. Des pH différents peuvent fournir des sélectivités significativement différentes (Fig. 2).

Fig 2.

Changements importants dans l'ordre d'élution entre les chimies de la colonne et les conditions de la phase mobile

Le mode HILIC est très utile pour améliorer la rétention des composés polaires. Cette technique peut présenter des défis en matière de robustesse, mais des choix judicieux de la phase mobile et des paramètres de la méthode peuvent conduire à des séparations réussies pour les composés difficiles.